Pengendalian Gene Transkripsional

 

Pengendalian Gene Transkripsional

Eva Sartini Bayu

Program Studi Budidaya Pertanian

Fakultas Pertanian

Universitas Sumatera Utara

I. PENDAHULUAN

Latar Belakang

RNA adalah asam nukleat. Struktur kimianya sama dengan DNA kecuali perbedaan-perbedaan berikut: (1) Kalau DNA adalah rantai ganda asam nukleat yang terdiri dari nukleotida-nukleotida yang digabung oleh ikatan fosfodiester 3' -> 5', maka RNA adalah rantai tunggal, (2) Kalau gula penyusun serat rantai DNA adalah deoxiribose (atom hidrogen mengganti gugus hidroksil pada posisi atom karbon nomor 2) maka gula dalam rantai tunggal RNA ditempati oleh gula ribosa, (3) Semua basa nitrogen thimin dalam DNA diganti oleh basa nitrogen urasil dalam RNA. Dengan demikian, basa-basa nukleotida penyusun RNA adalah A, U, G, T.

Dalam proses transkripsi, RNA disintesis menggunakan DNA sebagai cetakan. Karena RNA bukan sebagai molekul pekerja utama sistem sel, maka penyalinan DNA ke RNA belum mampu menerangkan bahwa informasi genetik dalam bentuk DNA telah diekspresikan. Jauh sebelum DNA diidentifikasi sebagai pembawa informasi genetik, telah diketahui bahwa protein dalam bentuk enzim merupakan mesin-mesin sel yang terlibat dalam berbagai reaksi biokemis. Setelah penelitian Jacob dan Monod (1961) mengidentifikasi peranan molekul antara yang labil keberadaannya maka terbangun suatu hubungan konsepsional penterjemahan informasi dari urutan basa DNA ke dalam urutan asam amino protein, atau struktur primer protein.

Molekul perantara ini temyata adalah RNA dengan klas yang berlainan dari yang telah diketahui saat itu. Molekul perantara itu disebut RNA duta (atau messenger RNA; mRNA) karena ia mengandung perintah bagaimana protein harus dibuat mRNA merupakan salinan dari urutan basa DNA dalam suatu gen, dan mRNA kemudian berfungsi sebagai cetakan dalam sintesis protein. Dalam proses ini, sandi genetik di dalam urutan basa nitrogen mRNA diterjemahkan ke dalam struktur protein. Setiap gen atau kelompok gen memproduksi mRNA dan kemudian diekspresikan ke dalam bentuk protein. Sebagai konsekuensi, mRNA adalah senyawa dengan klas yang sangat heterogen. Pada E. coli, misalnya, rata-rata panjang mRNA adalah 1.2 kb.

Kelas RNA yang lain adalah RNA transfer (tRNA) dan RNA ribosomal (rRNA), namun keterlibatan mereka adalah bagian dari mesin sintesis protein. RNA transfer (tRNA) membawa asam amino dalam bentuk yang diaktifkan ke dalam ribosom untuk pembentukan ikatan peptida, dalam suatu urutan yang ditentukan oleh mRNA sebagai cetakan. Terdapat paling tidak satu jenis tRNA untuk setiap keduapuluh empat asam amino yang ada. tRNA terdiri dari sekitar 75 nukleotida dan merupakan molekul RNA terkecil.

RNA ribosomal (rRNA) merupakan salah satu komponen utama ribosom. Peranannya dalam biosintesis protein masih dalam taraf pencarian. Ditemukannya RNA yang berfungsi sebagai enzim (Ribosim) memunculkan tanda tanya yang menggelitik. Pada E. coli, menurut perilaku pengendapan selama setrifugasi, terdapat tiga jenis rRNA yaitu 23S, 16S, dan 5S. Setiap molekul-molekul tersebut terdapat satu dalam setiap mesin ribosom.

Di dalam sel, rRNA ditemukan paling banyak dibandingkan RNA lain. Organisme tingkat tinggi juga memiliki beberapa RNA lain, misalnya small nuclear RNA (snRNA) yang berpartisipasi dalam penggutingan exon RNA (RNA splicing).

e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 1

II. PENGENDALIAN GEN TRANSKRIPSIONAL

Dalam biosintesis RNA, pemanjangan rantai nukleotida berlangsung arah 5' á 3' RNA, dikatalisis oleh suatu enzim, yang diberi nama RNA polimerase. Sewaktu RNA polimerase berinteraksi dengan promotor di daerah pengawalan dari suatu gen, maka sintesis RNA dimulai pada titik berangkat (startpoint), bergerak sepanjang DNA cetakan, dan menyalin salah satu rantai DNA cetakan (coding sequence) ke dalam rantai RNA sampai mencapai umtan DNA yang disebut terminator. Hasilnya adalah suatu molekul tunggal RNA yang disebut terjemahan utama (primary transcript).

Dari titik pengawalan sampai ke terminator didefinisikan sebagai satuan transkripsi, dan dapat mencakup lebih dari satu gen. Urutan DNA sebelum titik pengawalan transkripsi disebut hulu (upstream) dan urutan DNA setelah terminator disebut hilir (downstream). Terkadang, urutan DNA ditulis hanya menunjukan daerah yang mengandung sandi, yang sama dengan urutan RNA. Posisi basa dalam DNA itu dinotasi mulai dari titik pengawalan sebagai +1 membesar ke arah hilir. Notasi sebelum titik pengawalan adalah -1 kemudian bilangan negatifmeningkat ke arah hulu.

mRNA sebagai terjemahan utama bersifat tidak stabil. Dalam prokarion, mRNA mudah dihancurkan atau diproses membentuk hasil akhir yang matang. Dalam eukarion, mRNA dimodifikasi pada ujung-ujungnya, dan semua jenis RNA diproses ke arah pematangan dengan membuang sub-sub perintah yang memungkinkan setiap RNA berfungsi secara seluler.

Transkripsi yang dipercepat reaksinya oleh RNA polimerase, berlangsung dalam apa yang disebut gelembung transkripsi (trancription bubble) yaitu daerah dimana ikatan hidrogen dalam DNA dilelehkan sementara. Gelembung transkripsi, yang berukuran -18 pb itu, bergerak sejalan dengan bergeraknya RNA polimerase meneliti dengan cermat dan membaca salah satu rantai DNA yang mengandung sandi (coding region) serta menyalinnya ke dalam rantai tunggal RNA. Sewaktu RNA disintesis, terbentuklah hibrida RNA-DNA yang diprediksi (berdasarkan struktur RNA dalam kompleks RNA-RNA polymerase) berukuran lebih pendek dari gelembung transkripsi, sekitar -12 pb.

Eksperimen pemotongan RNA dalam kompleks RNA-RNA polimerase oleh ribonuklease bahkan menunjukan bahwa RNA dapat dipotong sampai sedekat 3 basa dari titik pertumbuhan RNA, yang menunjukan bahwa asosiasi RNA pada DNA hanya sekitar 2-3 basa saja. Lebih pendek dari itu, RNA melakukan pengikatan sangat kuat dengan RNA polimerase.

Jadi, kompleks sementara RNA-DNA berlangsung dalam waktu yang sangat singkat dan dalam ukuran yang sangat pendek, yang hanya cukup untuk memberikan keadaan mantap kepada hibrida RNA-DNA yang menentukan spesifisitas penambahan nukleotida. Sewaktu RNA polimerase bergerak maju, ikatan hidrogen yang ada pada bagian belakang gelebung transkrip berpasang-kembali. RNA yang terbentuk bergerak bebas kecuali sekitar 25 nukleotida masih tetap berasosiasi dengan kompleks enzim, dan mungkin berada pada saluran yang berukuran ~ 25A di dalam RNA polimerase.

Semua asam-asam nukleat disintesis dari senyawa prekursor, nukleosida 5' trifosfat, melalui reaksi kondensasi antara gugus 5' trifosfat dari nukleotida yang datang mendekat pada kompleks DNA-RNA polimerase dengan gugus 3'-OH dari nukleotida terakhir yang ditambahkan ke dalam rantai RNA yang bam dibentuk.

Akibat serangan nukleofilik ini, nukleotida yang datang kehilangan 2 gugus fosfat terminal (g dan b). Gugus fosfat pada posisi a digunakan dalam pembentukan ikatan fosfodiester dengan rantai RNA yang sedang disintesis. Dengan demikian, rantai RNA disintesis dari ujung 5' kearah ujung 3', dengan kecepatan reaksi ~40 nukleotida/detik pada suhu 37"C pada RNA polimerase bakteri. Reaksi ini jauh lebih lambat ketimbang replikasi DNA, yang berlangsung dengan kecepatan 800 pb/detik.

Sambutan (acceptability) nukleotida yang datang ke dalam kompleks transkripsi didasarkan pada kecocokannya dengan -salah satunya adalah tiga pasangan basa (kodon) yang

e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 2

ada dalam rantai DNA. Nukleotida yang datang itu mungkin mengalami supervisi dari RNA polimerase, untuk dilihat apakah nukleotida yang datang sesuai atau tidak. Ikatan fosfodiester diiakan teijadi hanya apbilah terdapat kecocokan dengan komplek RNA polimerase-DNA. Jika syarat kecukupan tidak dipenuhi maka nukleotidanya dilempar keluar kompleks transkripsi. Dengan demikian, diskriminasi berlangsung dan videlitas dijaga, namun tidak hanya didasarkan pada berpasangannya basa nukleotida, karena beberapa senyawa analog dapat disambut dengan baik dan menjadi bagian dari RNA.

Proses transkripsi dapat dibagi ke dalam beberapa tahapan: (1) Tahapan pengakuan cetakan (template recognition), (2) Tahapan pengawalan (initiation), (3) Tahapan pemanjangan (elongation), dan (4) Tahapan pengakhiran (termination). Dalam tahapan pengakuan cetakan, RNA polimerase membentuk kompleks dengan rantai ganda DNA, ikatan hidrogen dilelehkan, dan menciptakan gelembung transkripsi. Daerah yang dibutuhkan oleh RNA polimerase membentuk kompleks dengan rantai ganda DNA disebut promotor.

Tahapan pengawalan mendeskripsikan pembentukan ikatan nukleotida pertama dalam RNA. Enzim RNA polimerase tetap berada di daerah promotor sambil mensintesis ~9 nukleotida pertama. Namun demikian, pembentukan nukleotida pendek ini terkadang mengalami keguguran (abortion), yaitu: enzim mensintesis transkrip kurang dari 9 basa, melepaskannya kembali, dan memulai kembali mensintesis RNA baru. Tahapan pengawalan berakhir apabila ensim mampu mensintesis rantai RNA baru melewati batas panjang ini.

Tahapan pemanjangan adalah selang selama enzim bergerak sepanjang DNA cetakan dan memperpanjang rantai RNA. Sambil ia bergerak, ia membuka rantai ganda DNA dan menyingkapkan sandi rantai tunggal DNA dengan nukleotida-nukleotida yang datang menyerang ujung 3' dari rantai RNA yang sedang mengalami pemanjangan, membentuk molekul hibrida RNA-DNA di daerah yang dibuka gulungannya. Persis dibelakang gulungan DNA yang terbuka ini, rantai tunggal DNA berpasangan kembali membentuk rantai ganda dengan pasangan aslinya. RNA kemudian muncul sebagai rantai tunggal yang bebas, yang ujung pemanjangannya masih terkait dengan kompleks DNA-RNA-enzim.

Tahapan pengakhiran melibatkan pengakuan titik dimana tidak ada lagi basa yang ditambahkan ke dalam rantai. Untuk mengakhiri transkripsi, pembentukan ikatan fosfodiester harus dihentikan, dan kompleks transkripsi harus dibubarkan. Sewaktu nukleotida terakhir ditambahkan akan diikuti oleh runtuhnya gelembung transkripsi, dan dilepaskannya hibrida RNA-DNA. DNA kembali ke keadaan rantai ganda, RNA dan enzim dibebaskan. Umtan basa nukleotida dalam DNA yang digunakan agar teijadinya pengakhiran transkripsi disebut terminator.

Uraian transkripsi RNA

Seorang petani, yang menanam jagung di ladang akan sangat kaget kalau tanaman yang ditanamnya bersamaan, menghasilkan tanaman-tanaman yang waktu berbunganya berbeda-beda. la tentunya tidak dapat memanen tanamaimya secara bersamaan. Mengapa demikian?

Jika ternyata sang petani memang menanam benihnya dari campuan berbagai varietas, maka hal ini dapat dengan mudah dipahami sumber permasalahannya. Namun andaikan bahwa petani menanam varietas yang sama pada lingkungan tumbuh yang homogen. Berapa besar kemungkinan bunga-bunga itu akan bermunculan pada waktu yang berbeda-beda?

Dalam kenyataannya, sang petani begitu yakin bahwa tanamannya akan berbunga, bertongkol dan panen pada umur-umur tertentu dan bersifat serempak. Peluang untuk menyimpang dari umur yang telah ditentukan sangatlah kecil, atau secara praktis tidak ada.

Kepercayaan petani tersebut dari sudut pandang pengendalian aktifitas gen sangatlah beralasan bahwa munculnya kuncup bunga tanaman jagung merupakan proses yang sangat terkendali. Informasi genetika yang menentukan waktu berbunganya jagung diaktifkan setelahjagung mencapai umur tertentu.

e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 3

Cerita tentang pembungaan jagung di atas hanyalah sebuah contoh dari keteraturan-keteraturan umum yang ada dalam sistem-sistem biologi. Keteraturan yang ada itu diperoleh oleh sistem-sistem biologi dalam kurun waktu evolusi yang sangat panjang, yang memberikan kepada organisme tertentu suatu keuntungan relatifagar bisa bertahan hidup dari satu generasi ke generasi berikutnya.

Secara prinsipil, berbagai pola pengendalian aktifitas gen pada sistem-sistem biologi ditujukan untuk mengontrol empat hal berikut: (1) Kapan, (2) Dimana, (3) Berapa banyak, dan 4) Bagaimana pola koordinasi pengendalian antar gen. Namun sebagaimana telah dijelaskan pada bab-bab sebelumnya bahwa ekspresi gen berlangsung melalui tahapan-tahapan transkripsi dan translasi, maka pengendalian aktifitas gen yang ditujukan/atau berpengaruh pada keempat hal tersebut di atas dapat berlangsung pada tahapan-tahapan transkripsi, pasca transkripsi, translasi, dan pascatranslasi.

Pada organisme prokariotik, aktifitas gen terutama dikendalikan pada tahapan transkripsi, dengan beragam pola pengendaliannya, yaitu: (1) Pengendalian Aktifitas Gen pada Tahapan Inisiasi Transkripsi: interaksi promotor -RNA polymerase; (2) Operon; (3) Pengendalian Aktifitas Gen melalui Struktur RNA: Terminasi dan Antiterminasi; (4) Pengendalian fase litik dan lisogenik pada infeksi bakteriofage. Pada organisme eukariotik, karena DNAnya dipackage bersama-sama oleh protein histon sebagai nukleosom, posisi DNA terhadap nukleosom merupakan target penting pengendalian ekspresi gen.

Pengendalian Aktifitas Gen pada Tahapan Transkripsi

Dalam proses transkripsi, salah satu pilin dari pilin ganda DNA yang mengandung satuan transkripsi disalin kedalam urutan spesifik RNA. "Disalin" disini berati bahwa gen yang berada dalam urutan asam nukleat DNA disalin ke dalam urutan basa nukleat RNA. Pilihan DNA yang menjadi sumber penyalinan dinamakan "cetakan" (template) sedangkan pilinan komplementernya, yang karena merupakan representasi urutan RNA yang dihasilkan dari proses menyalin, disebut "rantai pengkode" (coding strand) (Lihat Ilustrasi).

Sintesis RNA dipercepat reaksinya oleh enzim RNA polymerase. Transkripsi dimulai ketika enzim tersebut berinteraksi dengan suatu daerah khusus berlokasi di pangkal suatu gen. Daerah khusus ini disebut promotor. Promotor melingkupi (surrounds) pasangan basa pertama yang akan disalin ke dalam urutan RNA, dan oleh karenanya disebut titik pengawalan (startingpoint). Dari titik ini, enzim RNA polymerase bergerak sepanjang rantai cetakan, mensintesis RNA, sampai mencapai suatu urutan pengakhiran (terminator). Mulai dari titik pengawalan transkripsi sampai pada pengakhiran adalah satuan transkripsi. Dari sekali proses penyalinan informasi dari titik pengawalan ke titik pengakhiran dihasilkan satu molekul tunggal RNA, yang dapat mengandung satu atau lebih gen.

Urutan DNA sebelum satuan transkripsi disebut daerah hulu (upstream), sedangkan daerah setelah titik pengawalan disebut daerah hilir (downstream). Arah transkripsi bergerak dari daerah hulu ke daerah hilir searah dengan biosintesis RNA dari ujung 5' ke ujung 3'. Pasangan basa pengawalan transkrispi ke arah hilir biasanya ditandai dengan bilangan + dan diawali dengan +1 dari titik pengawalan. Sebaliknya pasasangan basa sebelum titik berangkat ditandai dengan bilangan negatif dan dimulai dengan -1 dan menjadi semakin negatif ke arah hulu.

Hasil pertama dari proses penyalinan satuan transkripsi adalah transkrip primer. Transkrip ini memiliki ujung 5' dan ujung 3' dan bersifat sangat tidak mantap, sehingga sulit dikarakterisasi secara in vivo. Pada prokariotik, molekul ini dengan cepat dihancurkan (mRNA) atau dipotong menjadi molekul yang matang (rRNA dan tRNA). Pada eukariotik, transkrip primer dimodifikasi di kedua ujungnya (mRNA) dan/atau dipotong menghasilkan molekul yang matang untuk semua tipe RNA (mRNA, rRNA, dan tRNA).

Transkripsi secara ekslusif dikerjakan oleh RNA polimerase, namun demikian gen ditranskripsi bukan tanpa diskriminasi oleh enzim tersebut. Protein-protein lain, yang disebut

e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 4

faktor transkripsi, bertindak mengatur transkripsi. Mereka menentukan apakah suatu gen siap ditranskripsi atau tidak.

Transkripsi merupakan tahapan utama suatu gen dikendalikan. Tahap pengawalan merupakan titik kritis bahkan untuk beberapa gen merupakan satu-satunya titik pengendalian apakah suatu gen akan ditranskripsi atau tidak. Namun karena tahapan transkripsi itu sendiri terdiri dari beberapa tahapan, sejumlah tahapan itu dapat menjadi titik-titik pengendalian transkripsi.

Ada dua hal penting yang patut diperhatikan sehubungan dengan pengendalian transkripsi: (1) Bagaimana RNA polimerase menemukan daerah promotor dan protein-protein lain melakukan pengikatan spesifik dengan urutan tertentu basa nukleotida di daerah promotor; (2) Bagaimana protein-protein regulator berinteraksi dengan RNA polimerase dan dengan protein pengatur yang lain mengaktifkan atau merepresi tahapan-tahapan spesifik dalam pengawalan, pemanjangan, dan pengakhiran dari tahapan-tahapan transkripsi?

Interaksi promotor-RNA polymerase pada prokariotik

Transkripsi berlangsung pada gelembung transkripsi, di daerah mana DNA untuk sementara membentuk dua rantai tunggal. Salah satu rantai, oleh RNA polimerase digunakan sebagai cetakan. Sambil RNA polimerase bergerak sepanjang DNA menyalin/mengimlah urutan spesifik DNA ke dalam urutan spesifik molekul baru RNA (sintesis RNA), gelembung tersebut juga bergerak bersama. RNA yang baru dibentukpun semakin panjang.

Bergeraknya gelembung transkripsi bersamaan dengan gerakan maju RNA polimerase karena sambil RNA polimerase bergerak sepanjang DNA cetakan, iapun turut mendenaturasi pilin ganda DNA dibagian depan gelembung dan merenaturasi kembali dibagian belakang gelembung. Panjang gelembung transkripsi kurang lebih 18 pb, tetapi panjang daerah hibrida RNA-DNA di dalam gelembung itu lebih pendek. Pandangan klasik, melalui pembuktian tidak langsung, adalah sekitar 12 pb, walaupun belum pemah diukur secara langsung. Bukti yang lebih baru menunjukkan bahwa basa pada RNA sedekat 3 pb dari titik pemanjangan dapat dipotong oleh ribonuklease yang mengenal RNA rantai tunggal. Dengan demikian, RNA masih berasosiasi dengan DNA hanya sepanjang 2-3 basa dari titik pertumbuhan rantai, setelahnya RNA berikatan sangat kuat dengan RNA polimerase. Jadi hibrida RNA-DNA sangat pendek, bersifat sementara, dan hanya cukup untuk memberikan stabilitas bagi reaksi reaksi perpasangan basa yang menentukan spesifitas penambahan nukleotida diujung pemanjangan RNA.

RNA polimerase bakteri memiliki ukuran -90 x 95 x 160Å. Pada Yeast ukurannya lebih besar (-140 x 136 x 110Å). Analisis struktural menunjukkan bahwa keduanya memiliki kesamaan, yaitu bahwa terdapat suatu saluran atau alur dipermukaan protein dengan lebar 25 Å dan kedalaman 5 - 10Å, yang dapat saja sebagai alur lintasan DNA. Panjang alur dapat menampung 16 pb pada enzim bakteri, dan 25 pb pada enzim yeast, namun panjang demikian hanya merepresentasi sebagian dari seluruh DNA yang terikat selama transkripsi berlangsung. Dibagian yang melintang alur tersebut terdapat alur lain yang lebih sempit berukuran lebar 12 - 15 Å dengan kedalaman -20 Å, yang dapat menampung molekul RNA.

Enzim RNA polimerase pertama kali dikenal dari kemampuannya memasukkan nukleotida-nukleotida ke dalam RNA dibawah arahan DNA cetakan. Sekarang, RNA polimerase dilihat sebagai bagian dari suatu alat yang lebih kompleks yang terlibat dalam transkripsi. Kemampuan mengkatalisis sintesis RNA mendefinisikan komponen minimum yang dapat diderskripsikan sebagai RNA polimerase.

e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 5

Operon

Pengendalian aktifitas gen melalui struktur RNA: Terminasi dan Antiterminasi

Pengendalian fase litik dan lisogenik pada infeksi bakteriofage.

Struktur kristal partikel inti nukleosom pada resolusi 28Å (Luger et al., 1997)

Modifikasi protem histon yang mempengaruhi ekspresi gen

Histon adalah protein yang terdapat pada inti sel, sebagai bagian struktural kromosom sel-sel prokariotik. Protein histon terdiri atas H2A, H2B, H3, dan H4, mengepak DNA sedemikian ropa sehingga teijadi mampatan dengan faktor kurang lebih 10000 kali. Dalam pengepakan DNA, protein histon membentuk bak' kelereng yang dililiti oleh benang-benang DNA. Modifikasi protein histon yang mempengaruhi ekspresi gen

• Asetilasi/deasetilasi

• Fosforilasi

• Metilasi (Methylation)

• Ubiquitilasi (Ubiquitylatyion)

• Sumoilasi (Sumoylation)

 

III. KESIMPULAN

Dalam proses transkripsi, RNA disintesis menggunakan DNA sebagai cetakan. Karena RNA bukan sebagai molekul pekerja utama sistem sel, maka penyalinan DNA ke RNA belum mampu menerangkan bahwa informasi genetik dalam bentuk DNA telah diekspresikan. Jauh sebelum DNA diidentifikasi sebagai pembawa informasi genetik, telah diketahui bahwa protein dalam bentuk enzim merupakan mesin-mesin sel yang terlibat dalam berbagai reaksi biokemis. Setelah penelitian Jacob dan Monod (1961) mengidentifikasi peranan molekul antara yang labil keberadaannya maka terbangun suatu hubungan konsepsional penterjemahan informasi dari urutan basa DNA ke dalam urutan asam amino protein, atau struktur primer protein.

e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 6

DAFTAR PUSTAKA

Barton, K.A., Brill, H.J. 1984. Prospects in Plant Genetic Engineering, Dalam P.H. Abelson (ed). Biotechnology & Biological Frontiers. Washington. DC, American Association for the Advancement of Science.

Bowen. G.D, and A.D. Rovira. 1981. The effect ofmicroorganisms on plant growth. I. Development ofroot hairs in sand and agar. Plant soil, 15: 166 - 186.

Burr, T.J, M.N. Schroth, and T.W. Suslow. 1978. Increased potato yield by treatment of seedpieces with specific strain of Pseudomonas fluorescens and P. pulida. Phytopathol. 68: 1377-1383.

Chaleff, R. S. 1984. Isplation of Agronomically Useful Mutans from Plant Cell Culture, Dalam P.H. Abelson (ed.) Biotechnology & Biological Frontiers, Washington. DC : American Association for the Advancement of Science.

Dekeyser, R. D. Inze, dan Van Montagu. 1990. Transgenic plant. P. 273 - 250 dalam J.P. Gustafson (ed) Gene Manipulation in plant improvement II. Plenum Press, New York.

Hull. R. 1990. Non - conventional resistance to viruses in plants concepts and risks. p. 289 - 303 dalam J.P. Gustafson (ed) Gene Manipulation in plant improvement II. Plenum Press, New York.

e-USU Repository ©2005 Universitas Sumatera Utara 7

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MENGAKSES GENOM

I. Struktur Internal Nukleus
Nukleus memiliki struktur internal kompleks yang berhubungan dengan perannya dalam berbagai aktivitas biokimia. Tidak seperti sitoplasma yang masing-masing kompartemennya diselubungi membran, kompartemen dalam nukleus tidak memiliki membran.
Apabila bagian membran nukleus, DNA dan protein histon disisihkan, maka nukleus merupakan sebuah jaringan kompleks yang terdiri dari serat2 protein dan RNA yang disebut matriks nuklear.
Di dalam nukleus, kompleks DNA-protein yang menyusun kromatin bersifat dinamis. Protein-protein nukleus yang berperan dalam ekspresi genom bergerak dari sisi aktif yang satu ke sisi aktif yang lain. Histon linker secara kontinyu terlepas dan terikat kembali pada sisi-sisi pengikatannya dalam genom. Nukleolus merupakan pusat sintesis dan prosesing rRNA.

Domain kromatin
Kromatin adalah kompleks DNA genom dan protein kromosomal dalam nukleus eukariot. Tingkatan struktur kromatin dimulai dari level pengepakan terendah, nukleosom dan serabut 30 nm, sampai struktur kromosom paling kompak, kromosom metafase yang terjadi hanya selama pembelahan nukleus. Setelah pembelahan, seluruh kromosom menjadi kurang kompak dan tidak dapat dibedakan secara individu. Nukleus yang tidak sedang membelah memperlihatkan daerah gelap (heterokromatin) dan daerah terang (eukromatin). Heterokromatin mengandung DNA yang masih relatif kompak dibandingkan eukromatin. Terdapat dua macam heterokromatin, yaitu:
a. Heterokromatin konstitutif: bersifat permanen, merupakan bagian DNA yang tidak mengandung gen, meliputi sentromer dan telomer. Hampir seluruh bagian kromosom Y merupakan daerah heterokromatin.
b. Heterokromatin fakultatif, terdapat pada sebagian sel pada waktu-waktu tertentu, tidak bersifat permanen, Mengandung sebagian gen yang tidak aktif pada sebagian sel dan pada sebagian periode dari siklus sel. Pada saat gen2 ini tdk aktif, DNA menjadi kompak membentuk heterokromatin. Konfigurasi heterokromatin yang kompak menyebabkan protein2 yang berperan dalam ekspresi gen tdk dpt mengakses DNA.
Eukromatin tersebar sepanjang genom eukariot. Diduga eukromatin mengandung gen2 yang aktif sehingga dapat diakses oleh protein2 ekspresi. Didalam daerah eukromatin terdapat loop-loop DNA yang terikat pada matriks nuklear dengan perantaraan segmen DNA yang kaya dengan AT yang disebut matrix-associated regions (MARs) atau scaffold attachment regions (SARs). Loop2 DNA diantara titik-titik pengikatan nuklear matriks disebut domain struktural. Domain fungsional dpt diidentifikasi bila kromatin diberi perlakuan deoksiribonuklease I (e.g. DNAse I). DNAse I tidak dapat mengakses daerah DNA yang kompak. Daerah2 yang sensitif thd DNAse I terletak disepanjang kedua sisi gen2 yang diekspresikan, diduga karena memiliki konfigurasi yang lebih terbuka.

Domain fungsional dibatasi oleh sekuens insulator. Insulator scs (spesialised chromatin structure) dan scs' misalnya terdapat pada kedua sisi gen hsp70 dari lalat buah.

Insulator memiliki 2 karakteristik: (1) Kemampuan mengatasi efek posisional. Efek posisional adalah variasi ekspresi gen bila suatu gen disisipkan kedalam kromosom eukariot. Secara alamiah dalam proses insersi gen baru dapat menyisip kedalam daerah kromatin yang kompak dimana gen tsb inaktif atau menyisip ke daerah kromatin yang lebih terbuka dimana gen tsb dapat diekspresikan. Insulator scs dan scs' yang diletakkan mengapit kedua sisi gen untuk warna mata dan disisipkan kedalam kromosom drosopila mampu mengatasi efek posisional. Gen yang diapit oleh insulator tsb selalu diekspresikan dengan kuat. Kontras dengan variabilitas ekspresi ketika gen tsb disisipkan kedalam drosopila tanpa insulator. Diduga insulator dapat mengubah konfigurasi kromatin dan membentuk domain fungsional. (2) Insulator menjaga independensi domain fungsional dan mencegah 'cross talk' antara domain2 fungsional yang berurutan. Apabila scs dan scs' dikeluarkan dari posisi asalnya dan disisipkan diantara sebuah gen dan sekuens regulator bagian upstream dari gen tsb, maka gen tsb tidak lagi dapat merespon sekuens regulator asalnya. Hal ini menunjukkan bahwa dalam posisi normalnya, insulator mencegah suatu gen dipengaruhi oleh regulator lain yang domainnya berdekatan/berurutan dengan gen tsb. Diduga fungsi insulator didukung oleh protein pengikat DNA seperti Su(Hw) pada drosopila yang secara khusus terikat pada insulator.

Beberapa domain fungsional mengandung daerah kontrol lokus yang disebut LCR (locus control region). LCR berperan dalam pembentukan dan mempertahankan domain fungsional yang terbuka. Seperti insulator, LCR dpt mengatasi efek posisional. Tetapi berbeda dengan insulator, LCR juga menstimulasi ekspresi gen-gen yang terdapat didalam domain fungsionalnya. LCR diduga berperan dalam ekspresi gen-gen yang aktif hanya pada jaringan dan tahap perkembangan tertentu. Contoh LCR diantaranya LCR globin, terletak sekitar 12 kb upstream gen-gen globin. Mutasi pada daerah LCR tsb menyebabkan penyakit talasemia. LCR globin mengandung 5 situs DNA hypersenssif. Pada situs ini nukleosom mengalami modifikasi atau absen dan karenanya bersifat aksesibel terhadap protein pengikat DNA. Protein2 inilah yang mengontrol struktur kromatin dalam domain fungsional.

Situs2 yang hipersensitif terhadap DNAse I juga ditemukan dibagian upstream dari setiap gen yang terdapat dalam LCR beta-globin, pada posisi terbentuknya kompleks inisiasi transkripsi dengan DNA. Gen2 beta globin yang berbeda diekspresikan pada tahap perkembangan yang berbeda pada manusia. Ketika gen tsb aktif, daerah pembentukan kompleks insiasi transkripsi ditandai oleh suatu situs hypersensitif. Diduga ada tidaknya nukleosom menentukan ekspresi gen. Ekspresi gen off apabila situs terbentuknya kompleks insiasi transkripsi tertutup oleh nukleosom dan on bila akses ke situs tsb terbuka.

II. Modifikasi Kromosom dan Ekspresi Genom
Di atas telah dijelaskan tentang dua cara bagaimana struktur kromatin mempengaruhi ekspresi gen. Pertama, tingkat pengepakan kromatin menentukan apakah gen-gen dalam kromatin tsb dapat diekspresikan atau tidak. Kedua, apabila suatu gen aksesibel maka transkripsinya dipengaruhi oleh ketepatan dan posisi nukleosom pada daerah pembentukan kompleks inisiasi transkripsi.

II.1. Mengaktifkan genom
Nukleosom menentukan aktivitas genom eukariot, tidak hanya melalui posisinya pada untai DNA, tetapi juga melalui ketepatan struktur kimia protein histon didalam nukleosom sebagai penentu utama tingkat pengepakan kromatin. Modifikasi kromatin terjadi melalui modifikasi histon dan remodeling nukleosom.

A. Modifikasi histon menentukan struktur kromatin
Protein histon dapat mengalami berbagai modifikasi. Salah satunya adalah asetilasi histon, pengikatan grup asetil pada asam amino lisin pada daerah ujung N dari sumbu histon. Asetilasi mengurangi afinitas histon terhadap DNA dan diduga juga mengurangi interaksi antar nukleosom yang akan membentuk serabut kromatin 30 nm. Histon2 pada daerah heterokromatin pada umumnya tidak terasetilasi sementara histon2 pada domain fungsional terasetilasi.
Enzim yang berperan menambahkan gugus acetil pada histon adalah histone acetyl transferase (HAT). Contoh protein HAT adalah Protein Tetrahymena (p55) yang homolog dengan protein yeast GCN5 yang mengaktifkan pembentukan kompleks inisiasi transkripsi. Protein mamalia p300/CBP yang berperan dalam mengaktifkan berbagai gen juga memiliki aktivitas HAT. Jenis sel yang berbeda memiliki pola asetilasi histon yang berbeda.
Didalam nukleus HAT membentuk kompleks multiprotein seperti kompleks ADA dan SAGA pada yeast dan kompleks TFTC pada manusia. Kompleks yang berbeda mengasetilasi histon yang berbeda, sebagian lagi mengasetilasi protein2 lain yang berperan dalam ekspresi genom seperti faktor transkripsi basal TFIIE dan TFIIF.
Bentuk2 modifikasi histon yang lain adalah pengikatan histon dengan grup metil, grup pospat dan dengan protein ubiquitin. Modifikasi ini mempengaruhi struktur kromatin dan berdampak terhadap aktivitas seluler. Posporilasi histon H3 dan histon linker, misalnya, berhubungan dengan pembentukan kromosom metafase; ubiquitinasi histon H2B berhubungan dengan pengaturan siklus sel. Metilasi lisin ke-9 membentuk situs pengikatan bagi protein HP1 yang menginduksi pengepakan kromatin dan membungkam ekspresi gen, tetapi metilasi lisin ke-4 mendorong pembentukan struktur kromatin terbuka. Dalam domain fungsional β-globin, dan diduga dlm domain lainnya, metilasi lysine-4 berhubungan dengan asetilasi histone H3. Kedua tipe modifikasi tersebut dapat bekerjasama untuk mengaktifkan suatu daerah dalam kromatin.

B. Remodeling nukleosom mempengaruhi ekspresi gen
Tipe modifikasi kromatin kedua yang dapat mempengaruhi ekspresi genom adalah remodeling nukleosom, yaitu modifikasi atau reposisioning nukleosom dalam suatu daerah pendek dalam genom, sehingga protein2 pengikat DNA memperoleh akses ke situs2 pengikatannya. Remodeling diinduksi oleh proses yang menggunakan energi yang melemahkan kontak antar nukleosom dan DNA. Tiga macam perubahan dapat terjadi, yaitu:
• Remodeling, perubahan struktur nukleosom tetapi tidak melibatkan perubahan posisi. Bentuk perubahan struktural belum diketahui, tetapi bila diinduksi secara in vitro menghasilkan nukleosom dengan ukuran ganda dan peningkatan sensitivitas DNA terhadap DNase.

• Sliding, atau cis-displacement, pemindahan nukleosom secara fisik di sepanjang molekul DNA
  

• Transfer, atau trans-displacement, pemindahan nukleosom ke molekul DNA yang lain atau ke bagian yang tidak berurutan pada molekul yang sama.

Protein2 yang berperan dalam remodeling kromatin bekerja bersama dalam suatu kompleks besar. Salah satunya Swi/Snf pada eukariot, tersusun dari sedikitnya 11 protein. Adanya interaksi antara Swi/Snf dan HATs menunjukkan bahwa remodeling nukleosom dapat berhubungan dengan asetilasi histon. Swi/Snf tampaknya tidak memiliki efek menyeluruh pada keseluruhan genom, sementara HATs bekerja pada seluruh genom. Interaksi juga terjadi antara Swi/Snf dan protein yang mentarget sejumlah gen tertentu. Diduga protein2 tsb adalah aktivator2 transkripsi, yang masing2 bersifat spesifik pada sejumlah gen tertentu.

II.2. Membungkam genom
Pembungkaman (silencing) suatu gen tertentu dilakukan dengan membalik efek aktivasi dari asetilasi histon. Deasetilasi histon dan metilasi DNA memiliki efek silencing.

A. Deasetilasi Histon menekan ekspresi gen
Silencing dapat dilakukan dengan membuang grup asetil dari ekor2 histon sehingga membalikan efek aktivasi dari HATs. Hal ini melibatkan peran histone deacetylases (HDACs). Pada ragi terdapat protein Rpd3 yang menekan proses transkripsi.
HDACs terdapat dalam kompleks multiprotein. Salah satunya adalah kompleks Sin3 dari mamalia, yang tersusun atas sedikitnya 7 protein, termasuk HDAC1 and HDAC2, RbAp46 dan RbAp48 yang mampu mengikat histon. RbAp46 dan RbAp48 berhubungan dengan protein retinoblastoma. RbAp46 dan RbAp48 mengontrol proliferasi sel melalui penghambatan ekspresi berbagai gen sampai waktu dibutuhkan. Mutasi RbAp46 dan RbAp48 menyebabkan kanker. Kompleks deasetilasi lain misalnya NuRD pada mamalia dan Sir2 pada ragi.
Study tentang kompleks HDAC menunjukkan adanya keterkaitan antara berbagai mekanisme untuk aktivasi dan silencing genom. Sin3 dan NuRD mengandung protein yang mengikat DNA yang termetilasi. NuRD juga mengandung protein yang sangat mirip dengan komponen kompleks remodeling nukleosom, Swi/Snf dan NuRD secara in vitro dapat berperan sebagai mesin remodeling nukleosom.

B. Silencing genom dengan metilasi DNA
Metilasi DNA dapat pula menekan ekspresi gen. Terdapat hubungan antara metilasi DNA dan modifikasi histon.
Pada eukariot, basa sitosin pada DNA kromosom seringkali mengalami perubahan menjadi 5-metilsitosin dengan penambahan grup metil oleh enzim DNA methyltransferases. Pada vertebrata hingga 10% dari total jumlah sitosin dalam genom mengalami metilasi, pada tanaman metilasi dapat mencapai 30%. Pola metilasi tidak bersifat acak, terbatas pada sekuens 5′-CG-3′ pada mamalia dan 5′-CNG-3′ pada tanaman. Terdapat dua aktivitas metilasi. Pertama: pemeliharaan metilasi (maintenance methylation) yang berperan menambahkan grup metil pada untai DNA baru sesudah replikasi. Aktivitas ini menjamin untai DNA anak memiliki pola metilasi yang sama dengan untai DNA induk. Kedua: de novomethylation, yang menambahkan grup metil pada posisi yang sama sekali baru dan karenanya mengubah pola metilasi suatu daerah lokal dalam genom. Pada mamalia Dnmt1 adalah enzim DNA methyltransferase yang terutama berfungsi untuk maintenance metilasi, sementara Dnmt3a dan Dnmt3b berperan terutama dalam aktivitas de novo methylation.
Metilasi menyebabkan penekanan ekspresi gen. Gen-gen yang aktif terletak pada daerah-daerah yang tidak termetilasi. Pada manusia misalnya, 40-50% dari seluruh gen terletak dekat dengan pulau CpG (CpG islands). Gen-gen yang diekspresikan pada semua jaringan (housekeeping genes) memiliki pulau CpG yang tidak termetilasi, sementara gen-gen yang diekspresikan secara spesifik pada jaringan2 tertentu tidak termetilasi hanya pada jaringan2 dimana gen2 tsb diekspresikan. Pola metilasi dipertahankan setelah pembelahan sel, informasi yang menunjukkan gen-gen mana yang harus diekspresikan diwariskan kepada sel2 anak. Hal ini menjamin pada jaringan yang berdiferensiasi pola ekspresi gen dipertahankan sekalipun jaringan digantikan atau ditambah dengan sel2 yang baru.
Signifikansi metilasi DNA terlihat dalam studi tentang penyakit manusia. Sindrom ICF (immunodeficiency, centromere instability and facial anomalies) berhubungan dengan rendahnya level metilasi berbagai daerah dalam genom dan disebabkan karena mutasi pada gen Dnmt3b. Kondisi sebaliknya, tingginya level metilasi terlihat pada pulau CpG yang menunjukkan perubahan pola ekspresi pada jenis2 kanker tertentu.
Bagaimana metilasi mempengaruhi ekspresi gen? Protein2 pengikat metil (methyl-CpG-binding proteins) (MeCPs) merupakan komponen dari kompleks Sin3 dan NuRD histon deacetylase. Model yang diajukan adalah pulau CpG yang termetilasi merupakan target pengikatan kompleks HDAC yang kemudian melakukan modifikasi kromatin untuk membungkam gen-gen di sekitar daerah tersebut.

Metilasi berperan dalam imprinting genom dan inaktivasi kromosom X
Imprinting genom relatif tidak umum tetapi penting dalam genom mamalia. Dalam hal ini hanya satu dari sepasang gen pada kromosom homolog yang diploid yang diekspresikan. Gen lainnya dibungkam melalui metilasi. Dalam beberapa kasus, gen2 yang tidak aktif merupakan gen maternal.. dalam kasus2 yang lain gen-gen paternal. Sebanyak 30 gen pada manusia dan tikus menunjukkan fenomena imprinting. Sebagai contoh, Igf2 yang mengkode faktor tumbuh dan berperan dalam signaling antar sel. Pada tikus, hanya gen paternal yang aktif. Pada kromosom yang diwariskan dari ibu, berbagai segmen DNA yang terletak di daerah Igf2 mengalami metilasi sehingga mencegah ekspresi gen Igf2. Gen imprint lainnya, H19, terletak 90 kb dari Igf2 . Imprinting terjadi sebaliknya dimana gen maternal aktif dan gen paternal tidak aktif. Diduga imprinting berperan dalam perkembangan organisme. Tikus partenogenetik sistetis yang memiliki 2 kopi genom maternal tidak dapat berkembang sempurna.
Inaktivasi kromosom X adalah kasus khusus imprinting dimana terjadi total inaktivasi pada salah satu kromosom X mamalia betina. Karena betina memiliki 2 kromosom X dan jantan satu, maka bila kedua kromosom X pada individu betina aktif maka akan terdapat 2 x lipat protein2 yang dikodekan oleh gen2 pada kromosom X. Untuk menghindari hal ini maka salah satu kromosom X betina diinaktifkan. Pada nukleus kromosom X inaktif tampak sebagai struktur kompak yang disebut Barr body, seluruhnya terdiri atas heterokromatin. Silencing terjadi pada awal perkembangan embrio dan dikontrol oleh pusat inaktivasi X yang terdapat pada setiap kromosom X. Pada sel yang mengalami inaktivasi X, pusat inaktivasi pada salah satu kromosom X menginisiasi pembentukan heterokromatin dengan kekecualian pada beberapa segmen pendek yang mengandung sejumlah kecil gen yang tetap aktif. Inaktivasi X bersifat menurun dan diperlihatkan oleh semua sel yang berasal dari kromosom X yang mengalami inaktivasi. Mekanisme inaktivasi tergantung pada:
• Gen Xist, terdapat pada pusat inaktivasi yang ditranskripsikan menjadi 25-kb non-coding RNA, berfungsi dalam pembentukan heterokromatin;

http://23bios1unsoed.wordpress.com/dosen/catatan-kuliah/mengakses-genom/terjemahan-mengakses-genom/

http://id.wikipedia.org/wiki/Replikasi_DNA

 

Ekspresi genetik merupakan proses penerjemahan informasi genetik (dalam bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Informasi yang dibawa bahan genetik tidak bermakna apa pun apabila tidak diekspresikan menjadi fenotipe. Ekspresi genetik beserta dinamika yang mempengaruhinya dipelajari dalam genetika molekular beserta cabang-cabangnya seperti genomika, transkriptomika, proteomika, serta metabolomika.

[sunting] Proses ekspresi genetik

Proses ekspresi genetik mengikuti tahapan yang sama untuk semua bentuk kehidupan, dan disebut dogma inti (central dogma) dalam genetika. Ada tiga proses dasar yang tercakup dalam dogma inti:

• replikasi
  DNA,
  
• transkripsi
  DNA menjadi RNA, dan
  
• translasi
  RNA menjadi protein atau polipeptida.